熟读唐诗三百首，不会作诗也会吟，下面是可爱的小编帮家人们分享的耐药细胞生物学论文（优秀6篇），欢迎阅读，希望对大家有所帮助。
细胞论文 篇一
春节快要来临时，人体的细胞正在面对一场战争——病毒的攻击。
人体内的细胞国王是“白细胞”，它无时无刻都在消灭病毒，保护人体，可近期来了一种很强的病毒叫“新型冠状病毒肺炎”，就连白细胞国王也抵挡不了。原本以为是大自然破坏了人类的规律，没想到是人类破坏了大自然的规律，正是因为人们太贪吃所造成的，还去吃野生动物的肉，比如：蝙蝠、乌龟、天鹅等等。那些吃蝙蝠的人几乎都中招了，可以把蝙蝠比作潘多拉的盒子，只要一打开各种无情的怪兽正等着你，因为蝙蝠的身体里有各种病毒细胞，个个都是医学上的王者细胞，里面还含有死亡率的狂犬病病毒细胞，可怕的艾滋病病毒细胞。
人们不可以破坏大自然的规律，大自然也不可以破坏人类的规律，世间万物都是平等的。只有互相尊重，和谐共处，才能营造出一个美好的社会。
细胞生物学论文 篇二
关键词：生物工程；生产实习；实践教学
中图分类号：G642.0 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2017）23-0114-02
一、引言
细胞生物学是生命科学中一门重要的分支学科。细胞生物学主要从细胞的不同结构层次以及细胞间的相互关系来研究细胞生命活动（生长、分裂、分化、遗传变异、运动和兴奋、传导、衰老和死亡）的基本规律。从生命结构层次来看，细胞生物学位于分子生物学和个体生物学之间，同它们相互衔接、相互渗透。因此，从这一意义上来说，细胞生物学是一门承上启下的学科，和分子生物学一起同是现代生命科学的基础，并广泛渗透到遗传学、发育生物学、生殖生物学、神经生物学和免疫生物学等学科的研究中，和农业、医学、生物高新技术发展有着密切的关系，是生命科学的重要支柱之一[1]。
目前，国内已有过百所高校开设了细胞生物学专业，细胞生物学专业的培养目标是“使学生既掌握本学科的发展简史和前沿领域，又掌握细胞生物学的基础知识、基本概念和基本理论，使学生受到基本科学思维训练，同时使学生学会学习，具有自我开拓可获得知识和利用信息的能力。要求学生牢固掌握细胞的基本结构和功能及各细胞器间的关系的基本知识，并且能够掌握和了解细胞生物学的热点课题的现状和未来的发展趋势，包括生命信息流和细胞信息网络的研究、信号传递与细胞识别、神经活动的细胞及分子基础、蛋白质的加工与分选、发育的分子机制及遗传控制、细胞增殖、调控与编程死亡等，使学生对认识细胞的生命活动具有强烈的追求和探索精神，善于从生命现象探求其内在规律，能够运用现有的细胞生物学知识去研究生命科学中与细胞生物学有关的课题。”[2]当前，许多高校开设的细胞生物课程，针对学生综合能力的培养还不够，同时，缺乏专业性与系统性。本文针对本校细胞生物学课程存在的问题，在学校教改项目的支持下，探索“授之以鱼，不如授之以渔”的优化细胞生物学教学体系，融知识传授与能力培养为一体的教学新模式。
二、细胞生物学教学内容的优化
《细胞生物学》的内容涵盖植物、动物、细菌等多种生物，并且与其他学科内容交叉渗透广泛，因此教学过程中，容易导致主线不清晰，层次紊乱，内容繁杂等问题。在教学过程中，要使学生在脑海中建立起一个较为牢固的细胞生物学的知识体系和网络，这就要求在一线教学的我们更多地考虑授课的内容。
（一）突出重点，避免重复
细胞生物学课程内容涉及到微生物学、生物化学、植物生理学、动物生理学、遗传学和普通生物学等学科，这些专业课的内容在授课的时间上不一致。为了有效避免与先行课程中所讲授的内容出现重复，并且游刃有余地突出本课程在此知识点上特有的重点，必须对教学的内容进行优化。首先在教学的过程中应该掌握每个章节的内容与哪门课程的知识点重复；其次应了解与此知识点重复的课程的授课时间是否早于此知识点。若是，则在教授此知识点时，与细胞生物学不相关的内容则一带而过。若否，则建议在传授此知识点时，即使此内容与细胞生物学的内容相关性不强，但为了方便学生更加深刻地理解此知识点，则应简单介绍。比如在介绍线粒体和叶绿体这两个章节的内容时，电子传递链、氧化磷酸化和光合磷酸化的内容在生物化学课程中是作为重点讲授的内容。因此，在细胞生物学课程中，若学生已经具备了此知识点，则在讲课的过程中，我们应当简单提及此知识点，而重点阐述线粒体与叶绿体的结构与化学组成、其上蛋白的定位、代谢自主程度，核基因对其控制及其起源等。又比如细胞核与染色体章节中，在分子生物学和遗传学的内容中，都重点阐述了此部分内容，因此在细胞生物学课程中，仅做简单介绍即可。这样，使本学科与其他课程的知识紧密衔接又避免了不必要的重复，在有限的学时内，将重点内容最大化地传授给学生。
（二）贯穿前沿内容，贴近时展
细胞生物学是一门实验科学，科学在日新月异地发展，而我们的课本却并不能时刻地更新以顺应科学的发展。因此，这就要求我们的细胞生物学的教师不能因循守旧，只顾及课本的基础知识点。我们必须站在科学发展的前沿，掌握本领域科技发展动态，并将此动态转化为知识点的内容，及时传递给学生，激发学生对科研的热情，吸引其注意力。近年来的诺贝尔医学或生理学奖绝大多数都颁给了细胞生物学相关的研究领域，例如今年的奖项颁发给了日本科学家大隅良典，赞扬其在细胞的自噬作用方面的卓越贡献。当我们在传授“溶酶体的自噬作用”这一内容时，我们可以将此例先呈现出来，吸引学生的注意力，再将要讲授的知识点加以阐述，以便于学生对知识点的理解和记忆更加牢固。
（三）启发引导，对知识点适当延伸
改变传统的“教师在讲台上照本宣科，学生在台下死记硬背应付考试。”的僵化做法。在传授学生知识时，我们教师应该多用“问题导入法”来引出知识点，并让学生根据他们现有的知识，在脑海中搜寻相关的解释。这一方面让学生积极参与课堂之中，最重要的是让学生学会思考问题，比如在讲授“细胞的大小及体积恒定”这一小节时，可以先让学生思考一个问题：人和小鼠相应的器官都是由细胞组成的，比如心、肺、脾脏等，但是人的这些器官都比小鼠大很多，那么这到底是由于细胞的数量造成的，还是由于细胞的大小不一造成的？另外，每个知识点发F过程的背后都是有很有趣的小故事，在传授这些知识点之前，我们教师不妨先讲述一下这些小故事，从而激发起学生发现新知识的热情和动力，帮助学生学会预测、预见和构想未来事物的发展变化，不断增强学生的自觉性和创造性。
三、教学手段和方法的优化
在慕课和微课逐渐发展壮大的大背景下，我们教师应该通过整合网络上优秀的资源来进行授课。虽热目前慕课和微课的资源并不能完全涵盖整个细胞生物学的所有知识点，但部分已经成型。在上课前，我们可以让学生通过自学的方式先对知识点进行预习，通过上课提问的方式来了解学生学习的动态，这样可以有效避免因为教师“填鸭式”的授课让学生出现学习上的“惰性”。在上课时，我们可以通过“自学―讨论―总结”的教学模式来激发学生对学习以及探索的热情。
四、改革考核方法
下，各个院校最常用的考核方式局限于期末考试，这样带来的不可避免的一个问题就是，就算学生平时不怎么学习，只要在期末前几天突击一下，也可以取得一个不错的成绩。为了提高学生的综合能力，我们应当改变考核方式。考核应贯穿于整个课程学习之中，如布置课程论文就是一个提高学生综合能力的方法。在部分知识点或者章节讲授完成之后，给出一个研讨题，让学生以团队的形式共同查阅相关的文献，最终以PPT或者以课程论文形式进行专题交流研讨，这样不仅提高了学生的论文查阅能力、团队协作能力、语言表达能力，还提高了学习的主动性，对科研训练和毕业设计也将起到很大的作用。
五、结语
专业课是指导学生认识所学专业，规划未来发展方向的向导。因此在专业课的学习过程中，积极有效地引导大学生对待问题、解决问题的方式，这对培养学生的创新能力，拓展学生的视野有积极的意义。通过不断研究与探索细胞生物学教学体系，我们对细胞生物学的教学内容、方法与手段、考核方法等有了一定的认识。在今后教学实践中，我们会继续改进，提升教学质量，提高学生综合素质。
参考文献：
[1]邹东方，王喜忠。细胞生物学“教师、教材、教法”三位一体课程建设与改革[J].中国大学教育，2011，（10）：52-54.
[2]范纯新，郭弘艺，唐文乔。细胞生物学教学存在的问题与改革思路[J].中国校外教育，2011，（6）：76-77.
Practice and Explorations in Optimizing Cell Biology Teaching System
WANG Juan，WEI Cun-xu，ZHANG Long
（College of Life Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009，China）
Abstract：Cell Biology is one of the four mainstays of life science and it is also the frontal subject.This paper discuss the reform of teaching content，teaching methods and means，evaluation system about Cell Biology so as to improve the teaching quality，enhance student's practical capabilities as well as their comprehensive and problem solving abilities.
细胞生物学论文 篇三
医德教育不只是人文社科类教师的职责，而是全体教师的职责，医德教育应贯穿渗透于整个专业教育中。在医学细胞生物学实验课中，时刻加强学生医德医风的教育。比如，在实验操作中教育学生认真细致，因为将来他们面对的是鲜活的生命，他们在对病人的诊断和手术操作中不容许一点失误，否则将会造成无法弥补的后果。因此，在实验课上要求学生每一步操作都要小心翼翼，将实验操作想象成对病人的手术。另外，一些学生在写实验报告时出现错别字，不善于总结分析实验结果，这时要提醒学生在未来的工作中一旦病例上出现错误或者没有对病人的病情进行认真的分析都可能导致严重的医疗纠纷。通过这些在实验课中发现的问题教育培养学生一丝不苟、严谨细致的工作态度，提高医学生的整体医德医风。
2教学方式的改革
兴趣是学习最好的老师，但是现在单的教学方式往往使学生处于被动地位。因此，改变学生的学习地位，配合多元化的教学方式来调动学生学习的积极性成为亟待解决的问题。
2.1变被动学习为主动学习
中国当前的教育模式几乎仍是填鸭式教学，而实验课的教授更是老师讲解为主，学生完全处于被动地位。许多学生在实验过程中不知前因后果，只是草率结束实验，课后将实验内容抛之脑后，一无所知。为调动学生的主观能动性，在实验开始前，只是简单介绍相关的知识，提出实验目标。然后由学生在课下预习实验内容，查找资料，熟悉每一个实验步骤的原理、所需试剂的作用及配备方法，做好充足的准备工作。在实验结束后，分组讨论在实验过程中出现的问题，及对结果的多样性进行分析，鼓励大家畅所欲言，探讨该次实验内容能够用于解决哪些实际的问题。最后，要求学生认真整理出一份实验报告。在整个实验过程中，老师只起到引导、鼓励及评价的作用，而使学生处于主动地位。突然之间的角色转变使很多同学学习起来有些吃力，但是坚持一学期下来，发现学生的自主学习能力明显提高，这正是“授之以鱼，不如授之以渔”。
2.2变传统教学为多元化教学
现在一些高校的实验课教学方式仍为传统的板书讲解，这种教学方式早已不符合时代的发展。为使学生更直观生动的了解实验过程，将实验过程制作成录像，上课前通过多媒体播放教学示范录像。例如，对于原代培养细胞实验，前期的准备工作繁琐，耗时长，不可能每个同学都参与，这时通过播放教学示范录像[6]，使学生深刻了解整个实验的来龙去脉。另外，在实验课上由“老师讲”变为“学生讲”。课前要求学生预习实验目的、原理及注意事项等，上课时随机挑选学生为大家讲解，其他同学对讲解的内容进行补充和纠正。在显微镜的使用实验课中，将学生分为2～3人的小组，小组中的每位同学分别操作显微镜，其他同学在旁观看，指出这位同学在操作过程中存在的问题，进而加深学生对显微镜使用方法及注意事项的印象。
3考核方法的改革
随着对实验课的重视程度提高，实验课成绩在总成绩中所占比例也相应增加。实验课的考核不再只依靠实验报告，而在于对学生实验原理的掌握及实验操作能力的评价。通过课前提问形式，了解学生的预习情况并给予一定评分。在实验课结束时，随机抽取部分学生，考核其对该次实验中关键技术的掌握，如显微镜、离心机、天平等仪器的正确使用及临时装片的制备，并叙述在操作过程中的注意事项等，从而对学生的操作技能进行测试。另外，在批改实验报告时，主要依据学生对实验数据的分析及总结程度给予评分，强化学生的分析思考能力。
4结语
医学细胞生物学实验课程开展的目的不仅在于验证课堂教学理论，更重要的是培养学生的科研思维及动手操作能力。这促使我们调整教学内容，满足不同层次学生的学习需求；更新教学手段，激发学生的学习兴趣；完善考核体系，公平全面的评价学生。同时，在整个实验教学过程中，不断提醒加强学生的医德医风教育，以提高学生的整体素质。只有通过全面深入的教学改革，才能培养出高素质、高层次的医学人才。
细胞论文 篇四
教学重点：
1、细胞周期的概念。
2、细胞有丝分裂过程以及有丝分裂的特点
3、有丝分裂过程中DNA和染色体的规律性变化。
4、细胞分裂的意义
5、制作临时装片观察细胞有丝分裂的实验
教学难点：1、细胞周期的概念。
2、细胞有丝分裂的特点及意义
3、有丝分裂过程中DNA、染色单体和染色体的数量变化规律及其相互间的关系
教学过程：
讨论：生物体是如何长大的？
1、从物质转化角度分析：同化作用强于异化作用
同化作用主要发生在细胞的那些结构上？这使细胞发生了怎样的改变？
(引导学生简要复习细胞的结构和功能)
2、从细胞变化角度分析：细胞分裂——细胞数目增多
细胞生长——细胞体积增大
细胞的体积一般都是很小的，细胞生长到一定大小后就会通过细胞分裂使其体积减小。为什么细胞要进行细胞分裂呢？指导学生展开讨论。(请参考“细胞有丝分裂。ppt”)
学生总结：细胞分裂的生物学意义。
对于单细胞生物体，细胞分裂意味着生物个体数的增加。多细胞生物体的生殖活动也是通过细胞分裂完成的。对于多细胞生物体，细胞分裂则是生物体生长发育的基础。细胞分裂保证了细胞有足够大的表面积与环境进行物质交换，从而保证了新陈代谢对物质更新的需求。因此细胞分裂是生物体生长、发育和繁殖的基础。
根据对细胞分裂过程的观察，细胞分裂主要分为无丝分裂、有丝分裂和减数分裂三种不同的方式。
学生观察并讨论：认真观察39页青蛙红细胞细胞分裂图、37页植物分生组织细胞分裂图和107页产生精子细胞的细胞分裂过程图，简要说出他们的主要区别特点。
归纳总结：提出三种细胞分裂方式并比较主要不同。
三种细胞分裂方式中，无丝分裂通常是已经分化的细胞所采取的细胞分裂方式，如青蛙血液中红细胞的细胞分裂。(见扩展资料)减数分裂只发生于有性生殖过程中，多是用于产生有性生殖细胞如卵细胞或精子细胞等；而有丝分裂则是最常见的方式，如生长发育过程中体细胞的产生以及无性生殖过程中新个体或生殖细胞——孢子的形成……。人体就是经过连续的有丝分裂由一个受精卵细胞生长发育成的。
有丝分裂可以连续发生，具有明显的周期性——细胞周期。
学生阅读并讨论：
1、学生分析有关文字描述找出关键词语(什么样的细胞？起、止的标志？为何这样划分？)
2、根据图解描述什么是细胞周期。
3、一个细胞周期包括哪两个阶段？它们在时间分配上的特点是什么？如果观察一个正在进行有丝分裂的组织，处于哪个阶段的细胞会更多些？
(一个细胞从它产生开始直到它又通过细胞分裂变成两个相同的子代新细胞这就是一个周期。它包括分裂间期和分裂期两个阶段。)
细胞周期：连续分裂的细胞。从上一次分裂结束开始，到下一次分裂结束时为止。包括两次分裂间期的遗传物质复制，和分裂期的遗传物质的均分两个过程。
设问：为什么有丝分裂可以连续进行？
一般情况下，通过有丝分裂产生的全部细胞都具有相同的遗传性。克隆技术就是利用的这一原理。为什么有丝分裂能够产生相同的细胞呢？在一个细胞周期中分裂间期和分裂期这两个阶段各自完成了那些生命活动？
配合课件进行讨论学习，并且作笔记：
根据课本给出的数据等资料可以知道，在一个细胞周期中分裂间期占有极大的比例。分裂间期是一个新生的细胞进行物质积累生长成熟的阶段，与此同时这个细胞还要为新一代细胞的产生做好充分的物质准备。因此看似静止的分裂间期其实是细胞最繁忙的阶段。
根据给出的图形和照片比较并描述处于分裂间期的细胞具有哪些特点？是否发生了什么变化？分析造成这些变化的原因是什么？
分裂间期：为细胞分裂做物质准备。(占时90～95%)
细胞变化：细胞核大核仁明显，染色加深。核内渐出现染色体纤丝。
分子变化：DNA复制加倍，有关蛋白质大量合成。
总结：
1、细胞变化：细胞由扁变方，细胞核占有极大的比例。细胞核染色均匀，颜色渐深，核仁不止一个，非常显著。
2、物质变化(原因)：细胞核内完成了DNA分子的复制，细胞核内DNA分子数量增加了一倍。核酸容易被碱性染料染色，因此细胞核颜色明显变深。细胞内有大量的蛋白质被合成，其中有一部分与DNA分子一同构成染色体。根据书中图示可以知道复制的两个DNA分子是靠一个着丝点紧密地联系在一起的。(核仁部分见扩展资料。可以给接受能力较强的学生讲解。)
一切准备就绪后，细胞分裂就可以开始了。细胞分裂是一个相对较快的阶段，在这一阶段要完成遗传物质的均分和细胞质等结构的分离。分裂间期复制的DNA要完整地分离，使新形成的两个子代细胞分别获得完全相同的一整套DNA。如何保证复制的两套DNA分子能准确无误地分到两个子细胞中去呢？
根据课件引导学生讨论：
学习细胞分裂时要注意调动学生的积极性，引导学生学会观察——看图说话，学会抓重点、要点，学会比较、分析……。
细胞分裂是一个连续发展变化的过程，没有严格的阶段界限。在细胞分裂过程中细胞核的变化以及核内DNA、染色体的变化是观察的重点，遗传物质的平均分配是主线。要引导学生从中体会生命精密合理的美感。
为了研究方便，将有丝分裂的全过程被人为地分成前期、中期、后期和末期四个阶段。
细胞分裂期：细胞一分为二。主要是完成细胞核遗传物质的均分。(占时5～10%)
1、前期：
进入分裂期时首先要解决的问题就是要让细胞核内的DNA散出来，只有这样才可能实现遗传物质的均分。观察前期细胞模式图及其变化过程，描述分裂前期细胞的主要变化特点。染色质转变成染色体的生物学意义？
根据对动画、图解和照片的观察，描述有丝分裂前期细胞的变化过程及细胞特征。
染色质→染色体。
每个染色体含2条姐妹染色单体，复制的两个DNA分子分别位于两条姐妹染色单体上。
核膜、核仁消失，细胞核解体。纺锤体形成。
总结：
1、完成了DNA的复制及其相关蛋白质的合成后，核仁逐渐解体消失。阻碍DNA分离的核膜也随着解体消失。
2、DNA分子很大，数目也较多，遗传物质以染色质形式高密度地聚集在细胞核内。在细胞分裂初期染色质高度螺旋化变成染色体，可以使DNA分子在分离过程中不损坏，保证了遗传信息的完整性。
3、简要介绍纺锤丝的来源和纺锤丝体的形成。
4、关于染色体与染色单体、染色体与DNA的关系，可以通过照片及动画进行讲解。
重点讲解染色体的结构。让学生明确：染色单体形成于细胞分裂间期，在有丝分裂前期才能通过显微镜观察到。
2、中期：
根据对图解和照片的观察，描述有丝分裂中期细胞的特征。
DNA高度螺旋化。短粗的染色体清晰可见。
所有染色体的着丝点集中在“赤道板”上。
总结：
1、突出在纺锤丝的牵引下，染色体的着丝点集中到细胞中央的道板上。
2、强调赤道板是位于细胞中央部位的一个坐标面，不存在任何物质性结构。
3、由于染色体高度集中，造成纺锤体清晰可见。
4、强调绘图要点……。
3、后期：
根据对动画片段、图解和照片的观察，描述有丝分裂后期细胞的变化过程及特征。
染色体的着丝点分裂，姐妹染色单体分离。染色体数目增加一倍。
纺锤丝牵引染色体移向细胞两极。核遗传物质DNA均分。
总结：
1、在纺锤丝的牵拉下，每个染色体的着丝点分裂成两个。原来在一起的两条姐妹染色单体分离。——用词要准确。重点强调染色体数目增加的原因。
2、移向细胞两极的染色体上着丝点是受力点，染色体臂应该是顺向细胞中央的赤道板。
3、由同一条染色体上的姐妹染色单体分离形成的两条染色体，由于是复制品，因此形态、大小等特征应该完全相同。
4、末期：
遗传物质已经完成了均分过程，接下来就是细胞质的分离等收尾工作了。根据对图解和照片的观察，描述有丝分裂末期细胞的变化过程及特征。
DNA解螺旋，染色体→染色质。
新的核膜出现，细胞核重新形成。纺锤体消失。
赤道板中央位置出现细胞板，并向外围扩展形成新的细胞壁，细胞质分离成两部分。
1个亲代细胞→2个核遗传物质完全相同的子代细胞。
总结：
1、收尾工作与分裂前期正好相反。
2、由于细胞壁的物理特性，导致了植物细胞在分裂结束时只能是细胞板向外扩展形成新的细胞壁。
3、有丝分裂有效地保持了细胞内遗传物质的恒定性。对生物的遗传意义重大。
讨论：
1、为什么细胞只有在进行分裂的过程中出现染色体，其他阶段都以染色体形式存在呢？
2、同时出现或消失的结构都有哪些？其中细胞核结构与染色质几乎是同步存在的意义？
3、DNA是如何实现平均分配的？
4、简要说明有丝分裂的特点？其生物学意义是什么？
5、回味有丝分裂过程中精巧的程序设计，你从中能得到什么启示？
6、在一个细胞周期中，遗传物质的规律性变化设怎样的？可以通过哪些方式表示？
用表格形式如何表现？表格的优点是？
用曲线如何描述？优点是什么？
根据表格中的内容，用曲线描述一个细胞周期中DNA、染色体、染色单体的数量变化
根据这一图表可以清楚地读出一个细胞周期中各个不同阶段内DNA、染色体和染色单体的数量变化。
播放植物细胞有丝分裂过程动画
看有丝分裂过程中的“丝”，回忆遗传物质的均分过程。
展示动物细胞有丝分裂过程图片和动画片段，对比植物细胞的有丝分裂过程，讨论二者的异同。
讲解有关中心体的产生时间及组装过程(后者选讲)。
课堂练习：尝试用表格形式表示动物和植物细胞有丝分裂过程的异同。
讨论：
1、有丝分裂的特征和意义。
2、通过有丝分裂进行繁殖所产生的下一代个体有什么特点？
3、由同一个受精卵发育成的两个双胞胎个体应该具有什么特色？
4、科学技术方面有哪些成果是利用生物有丝分裂的特点实现的？
5、减数分裂与有丝分裂一样，在细胞进入分裂期以前也进行过一次遗传物质的复制过程。但是紧接着却连续发生了两次细胞的分裂——遗传物质两次被平均分配。你认为减数分裂产生的子代细胞中的遗传物质与亲代细胞相比还会相同吗？应该有什么特点？(这就是减数分裂名称的由来)
6、无丝分裂过程产生的子代细胞能否用于培养新一代个体？为什么？
7、分析比较三种细胞分裂方式的异同。他们各自适用于那些过程？为什么？(选作)
细胞生物学论文 篇五
1．1组织块贴壁法分离培养hUC-MSCs脐带取自正常分娩的新生儿(征得其父母同意)。首先用含双抗的磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗脐带3次，去除杂物；用无菌的手术剪刀将脐带剪成3～4cm的节段，再沿长度方向剪开，以暴露脐带胶质部分，去除血管；置于含双抗的PBS中清洗3次，去除血污，再剪成约0．5cm3的组织块，以胶质部分贴于基底平铺于24孔板中，每孔2～3块，置于37℃、体积分数5%CO2培养箱孵育1～2h;待组织块自然粘附于皿底部后加入含双抗、FBS的低糖DMEM培养基，继续置于培养箱内培养，每3d更换一次培养基，待观察到有小三角形或梭形细胞从组织中铺展出时，取出组织块。整个分离过程注意无菌操作。待细胞生长至70%～80%汇合时，即可传代。利用倒置相差显微镜观察细胞形态。取第5代细胞，采用细胞免疫荧光技术鉴定hUC-MSCs的表面标记物CD44。
1．2肝细胞标志基因的检测按照总RNA提取试剂盒的操作说明分别提取hUC-MSCs和人肝癌细胞HepG2的总RNA，用RNase-FreeDNaseⅠ去除基因组，最后检测RNA的浓度和纯度，立即进行反转录合成cDNA或保存于－80℃备用。采用Prime-ScriptTMⅡHighFidelityRT-PCR试剂盒反转录2μgRNA得cDNA，取2μL用于PCR。根据GenBank提供的人肝细胞标志基因序列，使用PrimerPremier5．0软件设计引物，引物序列和产物大小见表1。GAPDH为内参对照。PCR反应条件：94℃预变性5min;94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸5min。PCR产物用20g/L的琼脂糖凝胶电泳，在凝胶分析系统下拍照。
1．3PAS糖原染色按照PAS染色试剂盒的说明书操作，对第5代hUC-MSCs和HepG2进行糖原染色，在倒置相差显微镜下观察并照相。
2结果
2．1hUC-MSCs的分离、培养、传代及鉴定组织块贴壁培养3～4d时，可观察到组织块间隙铺展出小三角形或长梭形的细胞，继续培养至7d左右，可观察到局部细胞呈集落生长，此时，在无菌条件下取出组织块，更换新鲜培养基，继续培养1周左右，细胞可达80%～90%汇合，即可传代。用胰酶/EDTA消化后细胞呈亮而圆的单个分散状，以1∶3的比例进行传代，约4h贴壁，2d后迅速生长。倒置相差显微镜下可观察到细胞较大，轮廓清楚，内部有清晰的应力纤维，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显，呈典型的成纤维细胞样形态(图1A);持续培养大约2周时，细胞基本达到完全汇合，形态发生一定的变化，胞质变得狭窄，内部的应力纤维也不明显，呈平行排列或漩涡生长(图1B)。连续多次传代，细胞保持稳定的、相对均一的成纤维细胞样形态以及较强的增殖能力。经鉴定分离培养的细胞CD44呈阳性表达，且具有良好的均质性。
2．2肝细胞标志基因的表达以HepG2作为阳性对照，用RT-PCR检测hUC-MSCs的肝细胞标志基因的表达情况，结果见图2，hUC-MSCs表达ALB、CK18、G6P、GLUL和MET，不表达TAT。
2．3PAS糖原染色结果对hUC-MSCs和HepG2进行PAS糖原染色，染色结果显示两种细胞的细胞质中均有紫色颗粒物形成，即均呈糖原阳性反应(图3)。
3讨论
MSCs能分泌多种细胞因子和生长因子，具有直接或间接的抗炎及抗纤维化作用，可抑制肝细胞的死亡和纤维化；还可通过其分泌物抑制肝细胞的凋亡、刺激肝细胞再生、为受损肝细胞提供营养支持等。MSCs还具有低免疫原性及免疫抑制力，适用于进行同种异体移植，在移植后可迁移、归巢至受损的组织，发挥治疗作用。因此，MSCs在肝脏疾病的细胞移植治疗中具有广阔的应用前景。研究发现，相较不同来源的MSCs，脐带来源的MSCs不仅具有干细胞的特性，而且来源丰富、取材方便、增殖能力较强、无伦理法律限制，还具有较低的免疫原性和分化程度，从而成为一个非常有吸引力的移植治疗肝病的细胞来源。
作者采用组织块贴壁培养法从脐带基质中分离获得hUC-MSCs，与酶消化法和流式细胞仪或免疫磁珠分选法相比，该分离方法操作简单，消耗低，易于控制。分离培养的hUC-MSCs呈典型的成纤维细胞样形态，具有MSCs的表型特征，均质性良好，且在体外长期培养中能保持稳定状态。进一步的RT-PCR结果显示，培养的hUC-MSCs同时表达成熟肝细胞的标志基因ALB、CK18、G6P、GLUL和MET，而不表达TAT，与Campard等的研究结果一致，提示hUC-MSCs可能具有肝细胞的一些相关功能，如合成白蛋白、合成糖原及解毒功能等；PAS糖原染色结果则证明hUC-MSCs具有糖原合成和储存能力。
但上述结果并不能证明hUC-MSCs为成熟的肝细胞，在其他组织如卵巢、胰脏内也可发现ALB、角蛋白的表达。综上所述，组织块贴壁培养法可有效获得稳定、均质性良好的hUC-MSCs，其本身同时表达多种成熟肝细胞的标志基因并具有一定的肝细胞功能，可能更适宜于作为诱导性肝细胞的起始细胞或直接代替肝细胞用于移植治疗相关的肝脏疾病，从而满足基础研究与再生医学领域尤其临床应用对肝细胞的需求。
耐药细胞生物学论文 篇六
1、Real-time
RT-PCR检测耐药相关基因MDR1、BCL2L1、LRP、PRKCA的表达取对数生长期细胞，TRIzol试剂提取细胞总RNA，反转录试剂盒合成cDNA，SYBYGreen方法进行实时荧光定量PCR实验。引物设计由Invitrogen公司合成，见表1。PCR反应体系：cDNA1μl，2×SYBRGreenPCRMastermix12μl，引物F/R（上下游引物的终浓度各为15pmol/μl）各0.3μl，DEPC水11.4μl，共25μl。PCR循环设置：50℃2min95℃10min（95℃15s60℃1min）×40个循环（生成扩增曲线）95℃15s60℃15s95℃15s（生成溶解曲线）。SDS2.2软件分析处理数据，管家基因校正目的基因的表达，得到相对定量结果。1.6耐药细胞的保存耐药细胞SKOV3/TAX30分别冻存于含0、10、30nmol/L紫杉醇药物的冻存液里。于冻存后1、3、6月分别复苏细胞，观察复苏情况，MTT法检测IC50。1.7统计学方法对有关数据采用SPSS13.0软件进行独立样本t检验（independentsamplet-test）、单因素方差分析（OnewayANOVA），P<0.05为差异有统计学意义。
2、结果
2.1耐药细胞的建立
SKOV3经300μg/ml大剂量的紫杉醇作用2h后，大部分细胞死亡漂浮，剩余细胞肿胀，伸出树枝状突起呈蜘蛛状，胞质见空泡形成、颗粒增多。少量存活的细胞克隆生长，恢复生长至对数期消化传代，再进行下一次冲击；SKOV3经10~30nmol/L小剂量的紫杉醇作用24h，约50%的细胞死亡，细胞体积增大，形态不规则，胞质内颗粒增多，贴壁性变弱，给药24~72h内最明显，96~120h后逐渐恢复原状。经两种诱导方法获得的耐药细胞系，分别命名为SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30。
2.2耐药细胞的生物特性
2.2.1耐药指数MTT实验结果显示，耐药细胞及其敏感细胞的IC50值及耐药指数，可见小剂量浓度递增诱导的耐药细胞SKOV3/TAX30耐药性较强，见表2。2.2.2平板克隆形成实验在无药物作用时，SKOV3敏感细胞较两种耐药细胞系的克隆形成能力强，见图1A的d组，SKOV3敏感细胞的克隆形成数为（934±16.37），SKOV3/TAX300的克隆形成数为（440±13.75）,SKOV3/TAX30的克隆形成数为（579±9.50）。与敏感细胞SKOV3相比，两种耐药细胞克隆形成数少，差异有统计学意义（P均=0.000），见图1B。而在相同浓度紫杉醇作用下，耐药细胞形成的克隆明显多于敏感细胞。在紫杉醇浓度为5nM时，SKOV3/TAX30可形成（1206±9.50）个克隆，SKOV3/TAX300可形成（870±32.30）个克隆，而SKOV3形成的克隆数仅（202±6.08），差异有统计学意义（P均=0.000）；当紫杉醇浓度进一步升高为50nM和500nM时，SKOV3/TAX30和SKOV3/TAX300形成的克隆数仍明显高于敏感细胞SKOV3。紫杉醇浓度为50nM时，SKOV3细胞与SKOV3/TAX300细胞形成的克隆数相比，差异有统计学意义（P=0.013）,SKOV3细胞与SKOV3/TAX30细胞形成的克隆数相比，差异也有统计学意义（P=0.000）；紫杉醇浓度为500nmol/L时，SKOV3细胞与SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30细胞形成的克隆数相比，差异有统计学意义（P=0.009、0.0001），见图1B。2.2.3生长曲线倍增时间的差异SKOV3敏感细胞和两种耐药细胞系在相同条件下培养7天，细胞增殖产生一定的差异。耐药细胞的生长较敏感细胞减慢，生长曲线的斜率减小，见图2。同时，根据生长曲线计算出SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30细胞的倍增时间分别为28.90h、24.0h，与敏感细胞的倍增时间20.84h相比也有所延长。
2.3耐药相关基因
MDR1、BCL2L1、LRP、PRKCA在各细胞中的表达MDR1、BCL2L1、LRP、PRKCAmRNA在SKOV3、SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30细胞中的相对表达丰度见图3A、3B。两种耐药细胞中，MDR1的表达明显增高，提示SKOV3/TAX300、SKOV3/TAX30对紫杉醇的耐药与MDR1高表达有关。SKOV3/TAX300细胞中PRKCA、LRP的表达均高于SKOV3细胞，差异有统计学意义（P=0.016，P=0.005），BCL2L1的表达与敏感细胞比较，差异无统计学意义（P=0.815）。而SKOV3/TAX30细胞的PRKCA、LRP的表达与敏感细胞比较差异无统计学意义（P=0.154，P=0.206）。BCL2L1的表达低于敏感细胞（P=0.001），见图3B。以上数据表明不同诱导方式导致耐药细胞发生不同生物学变化，可能存在不同的耐药机制。
2.4耐药细胞的保存
耐药细胞SKOV3/TAX30分别冻存在含有0、10、30nM紫杉醇的冻存液中，于冻存后1、3、6月复苏，检测IC50，见表3。1、3月后检测结果提示，在3种药物浓度条件下的细胞IC50没有明显区别，但冻存6月后，无药冻存组的耐药细胞与两种加药冻存组的细胞比较，其IC50明显下降，差异有统计学意义（P<0.01）。同一个药物浓度条件下，无药冻存组的耐药细胞在冻存6月时，出现耐药性下降，而两种加药冻存组细胞在6月的冻存过程中，细胞IC50虽然出现轻度下降，但差异无统计学意义。
3、讨论
3.1耐药细胞的建立
本实验结果提示：增加给药剂量、适当延长无药间歇期，可能延缓细胞的耐药性。由于大剂量冲击诱导与临床治疗模式相似，临床上体内耐药指数≥2倍即足以导致化疗失败[5]，因此大剂量冲击诱导产生的耐药细胞虽然耐药指数较低，也是模拟临床耐药的良好模型。
3.2耐药细胞的特性
本研究的结果表明：在无药物作用时，SKOV3细胞的集落形成能力强于两种耐药细胞SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30，但在不同浓度紫杉醇药物条件下，耐药性最强的SKOV3/TAX30集落形成能力也最强，而敏感细胞SKOV3的集落形成能力最弱，此结果与MTT法检测的耐药性一致。紫杉醇的作用机制是促进微管蛋白二聚体装配成微管，抑制纺锤体形成，将细胞阻断于G2/M期，细胞的有丝分裂异常或停止，使多核细胞的形成增多[6]。诱导的过程中耐药细胞膨胀、形态不规则、细胞体积的增大可能与细胞群体中多核细胞的增多有关。本研究的生长曲线实验中，SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30的倍增时间分别为28.9、24.0h，与敏感细胞SKOV3的倍增时间20.84h相比有明显延长，显示耐紫杉醇的卵巢癌细胞生长速度减慢。细胞周期的阻滞，除导致一些细胞周期特异性药物失效外，肿瘤细胞处于相对静止状态，易对化疗药物产生耐受。
3.3耐药相关基因的检测
卵巢癌紫杉醇耐药机制的研究中，多药耐药（multidrugresistance，MDR）一直是热点。多药耐药是指对一种药物具有耐药性的同时，也对其他结构和作用机制完全不同的化疗药物产生交叉耐受的一种现象。多药耐药的产生是一个多因素的过程，主要包括：（1）细胞内有效药物浓度的降低；（2）细胞内药物活性的改变；（3）凋亡的抑制；（4）肿瘤细胞微环境改变化疗敏感度。P-gp是多药耐药基因MDR1编码的相对分子质量为17kD的一种跨膜糖蛋白，其功能是使细胞内药物浓度降低，药物的作用减弱或丧失，细胞由此获得耐药性。与大多数其他化疗药物的多药耐药机制相似，紫杉醇作为P-gp的作用底物之一，其耐药机制与MDR1基因扩增导致的P-gP高表达密切相关[7-8]。肺耐药相关蛋白LRP是在多药耐药的肺癌细胞株中发现的与MDR相关的非糖蛋白，相对分子质量为110kD，能阻止药物通过核孔进入细胞核，避免其作用于核内靶点，药物运送到胞质的囊泡中，再通过胞吐作用将药物排出体外，从而发生紫杉类药物耐药[9-10]。凋亡抑制基因也参于紫杉醇耐药。BCL2L1基因，全称为BCL-2样1基因（BCL-2-like1）,编码蛋白属于BCL-2蛋白家族，BCL-2蛋白家族通过抑制肿瘤细胞凋亡，导致耐药性[11-12]。PRKCA基因为蛋白激酶Cα（proteinkinaseCalpha），也被称为PKCA、PRKACA、KPCA、AAG6。细胞过度增殖和抗细胞凋亡机制障碍都可导致肿瘤进展和耐药现象发生[13]。另外PKC的作用是使底物蛋白磷酸化而活化，p-gp是PKC的作用底物，当其表达增加或活性增强时，可使大量的P-gp磷酸化而活化，从而产生耐药性。本研究结果提示。SKOV3/TAX300细胞PRKCA、LRP的表达均略高于敏感细胞。但SKOV3/TAX30细胞的PRKCA、LRP的表达与敏感细胞比较差异无统计学意义。BCL2L1在SKOV3/TAX30细胞的表达低于敏感细胞，但SKOV3/TAX300细胞中BCL2L1的表达略高于敏感细胞，结果提示不同方式诱导的耐药细胞，可能存在不同的耐药机制。
3.4耐药细胞的保存
研究表明耐药表型在无药培养液中具有不稳定性[14-15]，而且随着时间的推移，耐药水平也逐渐下降，有的甚至恢复到亲代细胞的敏感度。智星等[16]对耐阿霉素的人肝癌细胞采用持续加药培养的方法保种传代，可提供研究所用的具有相对稳定性的耐药细胞株。本实验在实验初期同样遇到了复苏长期保存的耐药细胞，发现其耐药特性丢失的问题，为了摸索化疗耐药细胞长期保存的条件，我们改变细胞冻存条件，将耐药细胞SKOV3/TAX30冻存在含一定药物浓度的冻存液中，冻存液中药物浓度根据细胞诱导时的药物浓度确定为10和30nmol/L。实验结果提示，耐药细胞冻存在含一定浓度化疗药物的条件下，较无药冻存更能保存耐药的稳定性，从而有利于提供稳定的体外模型。
作者：樊蓓 李红霞 吴玉梅 赵群 邓小虹